茉莉酸(jasmonicacid,JA)是一類(lèi)廣泛存在于植物中的內(nèi)源激素,不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控,還作為信號(hào)分子在植物響應(yīng)生物及非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Browse,2005;Michaeletal.,2015;Qu,Zhao,2011)?研究表明,COI1(coronatineinsensitive1)-JAZ(jasmonateZIM-domain)-MYC2(myelocytomatosisproteins2)是JA信號(hào)傳導(dǎo)的核心調(diào)控元件(Chinietal.,2010)?其中轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ蛋白,在JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中將茉莉酸受體復(fù)合體SCF(Skip/Cullin/F-box)COI1與下游轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)系起來(lái)?雖然已報(bào)道擬南芥(Arabidopsisthali?ana)?普通小麥(Triticumaestivum),但是仍未完全明晰JAZ蛋白調(diào)控植物應(yīng)答逆境脅迫的生物學(xué)功能。

供試材料為陸地棉(Gossypiumhirsutum)'中棉所24'(CRI24)?棉花標(biāo)準(zhǔn)系TM-1?二倍體栽培棉亞洲棉(Gossypiumarboreum)'石系亞1號(hào)'和二倍體野生棉雷蒙德式棉(Gossypiumraimondii)?將4種材料種子在自來(lái)水中浸泡12h,整齊擺放到浸濕的濾紙上;將濾紙卷成柱狀,下部空出8~10cm浸入水中,以保持濾紙濕潤(rùn),加水量以距離最下部種子1~2cm為宜?放入30℃?70%濕度和16h/8h(光照/黑暗)的光照培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供）中萌發(fā)3~5d,每隔12h加一次水?待子葉破殼后移種到Hoagland培養(yǎng)液中,繼續(xù)培養(yǎng),每隔3d更換一次培養(yǎng)液?待植株長(zhǎng)到三葉一心,挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移入12%(W/V)PEG6000培養(yǎng)溶液;分別在處理后的0?0.5?1?3?6和12h取根?莖和葉,液氮速凍,于-80℃保存,用于脅迫條件下表達(dá)模式分析?另將CRI24種子播種于試驗(yàn)田,常規(guī)種植,取開(kāi)花期植株的根?莖?葉?花?萼片?胚珠?雄蕊?雌蕊和不同時(shí)期的纖維以及收獲后的種子,液氮速凍,于-80℃保存,用于組織表達(dá)分析?基因轉(zhuǎn)化受體和野生型對(duì)照均為擬南芥(Ara?bidopsisthaliana)Colombia0(Col-0)型?將轉(zhuǎn)基因株系和野生型的擬南芥種子用50%次氯酸鈉消毒5min,隨后用滅菌H2O清洗5~6次;在4℃條件下春化2d,然后種在MS(MurashigeandSkoogStock)培養(yǎng)基?生長(zhǎng)8~10d后,株系移栽到蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土為1.2∶1的土壤中生長(zhǎng)?于培養(yǎng)皿中進(jìn)行滲透脅迫處理:將消毒?清洗?春化后的種子均勻點(diǎn)播在MS和MS+Man(Mannitol甘露醇)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)?擬南芥和用于亞細(xì)胞定位的煙草(Nicotianatabacum)均生長(zhǎng)于22℃?16h/8h(光照/黑暗)的溫室中。

陸地棉CRI24三葉一心期根?莖和葉的混合組織樣,液氮研磨至粉末狀,采用RNAprepPure試劑盒(TIANGEN,北京)提取總RNA?利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TrabsScriptAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCR(One-StepgDNARemoval)(全式金,北京)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板?根據(jù)陸地棉基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cgp.genomics.org.cn/)GhJAZ10基因序列,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GhJAZ10基因?引物序列如下:GhJAZ10-F:5'-GCGGCCGCATGTCGTCTTGCTCGGAATCTAC-3'(劃部分為NotⅠ酶切位點(diǎn));GhJAZ10-R:5'-CCTGCAGGTGGTGATTGAGCAGCCAAACCG-3'(劃線(xiàn)部為SbfⅠ酶切位點(diǎn))?PCR反應(yīng)體系為:TaKaRaLATaq(5U/μL)0.5μL,10×LATaqBufferⅡ(Mg2+Plus)5μL,dNTPMixture(2.5mmol/L),1000ng/μLcDNA模板2μL,10μmol/L正反向引物各1μL,以ddH2O補(bǔ)足至50μL?PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性1min;98℃變性10s,60℃退火30s,68℃延伸1min,32個(gè)循環(huán);68℃延伸10min?利用NotⅠ和SbfⅠ對(duì)克隆序列和表達(dá)載體GW303(重慶大學(xué)任茂志老師饋贈(zèng))進(jìn)行雙酶切,利用DNA連接酶SolutionⅠ(TaKaRa,大連)連接獲得重組質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacterium)GV3101。

以GhJAZ10推導(dǎo)的氨基酸序列為目標(biāo)序列,在NCBIBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站上進(jìn)行BlastP分析,獲得各物種同源基因并下載相應(yīng)序列?利用DNAManv6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),用MEME(http://meme-suite.org/)對(duì)GhJAZ10進(jìn)行motif分析?采用在線(xiàn)軟件GeneStructureDisplayServer(GSDS:http://gsds.cbi.pku.edu.cn)對(duì)GhJAZ10的外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行分析。

棉花根?莖?葉?花?種子?萼片?雄蕊?雌蕊?胚珠?纖維組織和12%PEG6000脅迫處理0?0.5?1?3?6和12h的根?莖和葉組織,以液氮研磨至粉末狀;參照1.2.1方法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,對(duì)GhJAZ10表達(dá)量進(jìn)行分析

對(duì)克隆獲得的GhJAZ10基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),該基因(GenBankNo.XM_016834302.1)全長(zhǎng)723bp,編碼240個(gè)氨基酸;包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子?該基因編碼產(chǎn)物含有1個(gè)高度保守的TIFYXG結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端Jas保守結(jié)構(gòu)域?以GhJAZ10氨基酸序列為探針,在NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到同源的亞洲棉?雷蒙德式棉及其他物種同源氨基酸序列?利用DNAMan軟件進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果顯示,GhJAZ10氨基酸序列與棉屬間2個(gè)基因GaTIFY10A-like(Gossypiumar?boretum,XM_017791531.1)?GrTIFY10A-like(Gossyp?iumraimondii,XM_012590406.1)的相似性均在95%以上;與其他物種間的相似性在60%左右,其中與哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)HuTIFY10A(XP_021277209.1)的相似性最大(65%)?上述結(jié)果表明,棉屬之間的序列相似性很高,在進(jìn)化過(guò)程中該基因未發(fā)生明顯的堿基改變;而與其他物種同源基因的序列差異較大?盡管如此,不同物種的序列都具有保守的TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域,而該兩種結(jié)構(gòu)域是JAZ蛋白發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)?在MEME網(wǎng)站對(duì)TIFY和Jas進(jìn)行motif序列分析,結(jié)果顯示,TIFYmotif的氨基酸序列為T(mén)IFYXG,Jasmotif的氨基酸序列為SLX2FX2KRX2RX5PY。