阿爾茨海 默 癥（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ），又 稱 為老年癡呆癥或早老性癡呆癥，是老年期常見的一種 以 認(rèn) 知、記憶障礙為主要特征的神經(jīng)退 行性疾病。 ＡＤ的發(fā)生和 發(fā) 展 是 細(xì) 胞 和 生 物 體 內(nèi) 復(fù) 雜 的 調(diào) 節(jié) 網(wǎng) 絡(luò)和調(diào)節(jié)因子相互作用的結(jié)果。中醫(yī)藥多靶 點 和 多 環(huán)節(jié)作用的特點，使其在增強(qiáng)療效、改善患者 生 活 質(zhì) 量、降低化學(xué)藥物劑量和減少化學(xué)藥物毒副作用等方 面具有優(yōu) 勢。中 醫(yī) 藥 未 病 先 防、既 病 防 變 的 獨 特 優(yōu) 勢，使其在延緩疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了積極作用。 因此，中藥成為挖掘防治 ＡＤ 新 藥 的 重 要 資 源，而 藥 食兩用中藥因具有藥性平和、不良反應(yīng)少等 特 點，成 為“治未病”的首選藥物。

１ 材料與方法

１．１ 實驗動物

ＳＰＦ級健康雄性ＳＤ大鼠２５只，體重１６０±１０ｇ， 由三峽大學(xué)實驗動物中心提供，實驗單位許可證編號 ＳＹＸＫ（鄂）２０１７－００６１，動物批號４２０１０２００００２１２５。

１．２ 主要儀器和試劑

ＳＤ－１００旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本 ＥＹＥＬＡ 公司），ＨＥＶ－ ５０自動滅菌鍋（日本 ＨＩＲＡＹＡＭＡ 公司），Ｍｏｒｒｉｓ水 迷宮視頻 跟 蹤 分 析 系 統(tǒng)（成 都 泰 盟 軟 件 有 限 公 司）， Ｉｎｆｉｎｉｔｅ? ２００ 酶 標(biāo) 儀 （上 海 安 景 科 技 有 限 公 司 ）， ５４１５Ｒ小型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德股份公 司），精宏DK-8A電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。９５％乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）， 東莨菪堿（上海安譜科學(xué)儀器有限公司），蛋白定量測 試盒、ＡＣｈＥ試 劑 盒、ＳＯＤ 測 試 盒、ＭＤＡ 測 試 盒（南 京建成生物工程研究所）。

１．３ ＭＥＥ的制備

１．３．１ 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)

①制備馬鈴薯提取液：去皮馬鈴薯１００ｇ，切成小 塊加水至 １．０Ｌ，煮沸３０ｍｉｎ，直至馬鈴薯塊軟化，濾 去馬鈴薯塊，將 濾 液 補(bǔ) 足 至１．０Ｌ；
②菌 種 活 化 培 養(yǎng) 基：馬 鈴 薯 提 取 液 １．０Ｌ，葡 萄 糖 ２０．０ｇ，ＭｇＳＯ４ · ７Ｈ２Ｏ１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４３．０ｇ，瓊脂１５．０ｇ，維生素 Ｂ１ 微量；
③ 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基：馬 鈴 薯 提 取 液 ５．０Ｌ，葡 萄 糖１００．０ｇ，ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ７．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １５．０ｇ，酵 母 ＦＭ８８８５０ｇ，維生素 Ｂ１ 微量，ｐＨ６．０；
④將菌種活 化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基于１２１℃、０．１ ＭＰａ滅菌箱中 滅菌 ３０ｍｉｎ，滅菌后將菌種活化培養(yǎng)基倒于１２ｍｍ 滅菌平板中凝固，后取保種管中羊肚菌菌種，接 種 于 滅菌平板中，于２７℃ 培養(yǎng)６～８ｄ，羊肚菌長滿平板， 菌絲灰白色。將活化后的羊肚菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基 中，２７℃培養(yǎng) ３０～４０ｄ。

１．３．２ 羊肚菌菌絲體提取

收集羊肚菌菌 餅，５０℃條 件 下 烘 干，稱 重 后 即 為 羊肚菌干菌絲體質(zhì)量，粉碎后，使用９５％乙醇７０℃條 件下加熱回流提取３次，每次提取時間為２～３ｈ，過 濾，合 并 濾 液，用 旋 蒸 儀 在６５℃下 對 濾 液 濃 縮，得 到 總提物濃縮液，濃縮液揮干溶劑后得到 ＭＥＥ浸膏。

１．４ 實驗動物分組及 ＡＤ模型的建立

取健康雄性 ＳＤ（１６０±１０ｇ）大 鼠２５只，隨 機(jī) 分 為５組，每 組 ５ 只，即 空 白 組、東 莨 菪 堿 模 型 組、低 （１００ｍｇ／ｋｇ）、中（２００ｍｇ／ｋｇ）、高（４００ｍｇ／ｋｇ）劑量 ＭＥＥ 組。 給 藥 組 每 天 按 體 重 給 藥，給 藥 容 積 為 １０ｍＬ／ｋｇ，空白組和 模 型 組 每 天 給 予 等 量 的 生 理 鹽 水，連續(xù)灌胃１０ｄ后進(jìn)行水迷宮測試，每天對大鼠進(jìn) 行稱重記錄。 本研究采 用 腹 腔 注 射 東 莨 菪 堿 的 方 法 建 立 ＡＤ 動物模型，ＭＥＥ末次給藥１ｈ后，除空白組給予等體 積生理 鹽 水 外，其他各組大鼠 腹腔注射東莨菪堿 （２ｍｇ／ｋｇ），造成記 憶 獲 得 障 礙 模 型，３０ ｍｉｎ后 進(jìn) 行 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮測試。

１．５ Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮測試

Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮測試包括定位航行實驗和空間搜 索實驗。造模３０ｍｉｎ后，開始進(jìn)行定位航行實驗，水 溫２０℃左右，每天每只大鼠訓(xùn)練６次，每一次將大鼠 從平臺位置的對面放入水中，記錄其在１２０ｓ內(nèi)尋找 到平臺的時間（即實驗中設(shè)定的逃避潛伏期），連續(xù)訓(xùn) 練６ｄ。如果大鼠在１２０ｓ內(nèi)未找到平臺，則牽 引 至 平臺上，讓大鼠停留１５ｓ，再放回籠中，其逃避潛伏期 記為１２０ｓ。 第７ｄ進(jìn)行空間搜索實驗，撤 除 平 臺，任 選 一 個 入水點將大鼠放入，記錄其１２０ｓ內(nèi)跨越原平臺位置 的次數(shù)，同時記錄大鼠在目標(biāo)象限的時間，路 程 以 及 大鼠在１２０ｓ內(nèi)運動的總路程，結(jié)果以目標(biāo)象限距離 百分比（％）表示。

１．６ 組織樣本采集

空間搜索實驗結(jié)束后第２ｄ采集標(biāo)本。實驗前， １０％水合氯醛 以１０ ｍＬ／ｋｇ給 藥 體 積 進(jìn) 行 腹 腔 注 射麻醉，腹主動脈取血，然后迅速取出大腦，用稱量紙稱 取重量，按腦組織重量（ｇ）與生理鹽水體積（ｍＬ）比為 １∶９，冰水浴條件下進(jìn)行組織勻漿，２０００ｒ／ｍｉｎ× １５ｍｉｎ，取上清液，－２０℃下冷凍保存。

１．７ 生化指標(biāo)測定

取組織勻漿上清液，測 ＡＣｈＥ 和 ＳＯＤ 活性以及 ＭＤＡ 含量，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。 １．８ 統(tǒng)計學(xué)方法 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮中采用逃避潛伏期（ｓ）和目標(biāo)象限 距離百分 比（％）為 參 數(shù) 評 價 大 鼠 的 學(xué) 習(xí) 記 憶 能 力。 數(shù)據(jù)采 用 ＳＰＳＳ１９．０ 軟 件 進(jìn) 行 分 析，計 量 資 料 以 均 值±標(biāo)準(zhǔn)差（ｘ±ｓ）表 示，組間比較采用單因素方差 分析。以Ｐ＜０．０５為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

２ 結(jié)果

通過菌絲體培養(yǎng)，得到羊肚菌干菌絲體總重量為 ２０８．６３ｇ，使用９５％的乙醇提取３次，濾液合并 揮 干 后得到羊肚菌提 取 物 浸 膏 總 重 量 為３７．９５ｇ，提 取 率 為１８．１９％。在定位航行實驗（第１～６ｄ）中，隨著 訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐 漸 縮 短，提 示各組大 鼠 對 尋 找 水 中 平 臺 有 了 一 定 的 記 憶 能 力。 第１、２、３、５和６ｄ時，與空白組比較，模型組的逃避 潛伏期明顯延長，提示模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下 降。第２ｄ時，低、中、高劑量 ＭＥＥ 組逃避潛伏期較 模型組明顯縮短（均 Ｐ＜０．０５），提示 ＭＥＥ 對東莨菪 堿所致的 ＡＤ大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有明顯的改善作 用。第２、３、４ｄ時，中劑量 ＭＥＥ組較低劑量 ＭＥＥ組 逃避潛伏期顯著延長（均 Ｐ＜０．０５）；而高劑量 ＭＥＥ 組僅在第２ｄ其逃避潛伏期較低劑量 ＭＥＥ組明顯延 長（Ｐ＜０．０５），提 示 ＭＥＥ 對 東 莨 菪 堿 所 致 的 ＡＤ 大 鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用無明顯劑量依賴關(guān)系。

３ 討論

ＡＤ、帕金森病等常見神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率 高，且有逐年上升趨勢，但目前仍缺乏有效的治愈方 法。眾多實驗和臨床研究表明，膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)和 記憶中具有重要作用，而膽堿能的傳遞是通過乙酰膽 堿實現(xiàn)的。在生理條件下，膽堿能神經(jīng)元可以合成大 量乙酰膽堿（ａｃｅｔｙｃｈｏｌｉｎ，ＡＣｈ），而 ＡＣｈ是與 ＡＤ 發(fā)生密切相關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其合成減少、釋 放 減 少 或其受體敏 感 性 降 低 均 與 ＡＤ 的 發(fā) 生 相 關(guān)。研 究 發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志寡糖酯可通過降低 ＡＣｈＥ活性對腹腔注射 氫溴酸東莨菪堿所致小鼠記憶功能障礙的膽堿能 神 經(jīng)系統(tǒng)有一定的恢復(fù)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿 苷能降低 ＡＤ大鼠海馬內(nèi) ＡＣｈＥ活性，提高乙酰轉(zhuǎn)移 酶（ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）的表達(dá)，增加大腦皮 質(zhì) ＡＣｈ含量，從而改善 ＡＤ 大鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系 統(tǒng)功能，提示降低 ＡＣｈＥ 的活性可增加 ＡＣｈ的含量 進(jìn)而改善 ＡＤ 大鼠膽堿 能 神 經(jīng) 系 統(tǒng) 功 能。本 研 究 通 過行為學(xué)實驗和 ＡＣｈＥ 活性測定發(fā)現(xiàn)，ＭＥＥ 可能通 過降低 ＡＣｈＥ 活性對東莨菪堿所致 ＡＤ 大鼠的空間 學(xué)習(xí)記憶行為和膽堿功能障礙起到改善作用。